細胞計數器原理

細胞計數器原理

細胞培養技術(shù)中，細胞計數是一項基本功，對于標準化培養條件以及需要定量的實(shí)驗來(lái)說(shuō)都關(guān)鍵。這里介紹使用血細胞計數器對細胞進(jìn)行計數的經(jīng)典方法以及中間一些需要注意的細節。
制備細胞懸液：
對于貼壁生長(cháng)的細胞，我們需要使用胰酶消化的方法使細胞從培養皿表面脫落
根據需要加入合適體積的培養基，將細胞進(jìn)行中和及稀釋?zhuān)缘玫骄|(zhì)的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹打散開(kāi)，不要殘留任何細胞團
準備血細胞計數器：
使用70%乙醇將蓋玻片和血細胞計數器清潔干凈
將將蓋玻片潤濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細胞計數器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細胞計數器上
臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計算細胞的活力，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合
室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭進(jìn)入死細胞，使死細胞著(zhù)藍色
血細胞計數器加樣：
使用吸管將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到血細胞計數器計數池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計數池
以同樣的方式在另一側的計數池中也加入細胞懸液
將計數板放置幾分鐘使細胞擴散，同時(shí)用吸水紙吸除多余的液體
細胞計數：
在100倍顯微鏡下，移動(dòng)計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線(xiàn)包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區差不多剛好可以填滿(mǎn)整個(gè)視野
使用手持式計數器記錄計數池四個(gè)角以及中央方塊內的細胞數（1-5號位置，經(jīng)典的current-protocol推薦每個(gè)方塊細胞數應不大于20-50），并重復記錄另一側計數池中的細胞數，總計十個(gè)方塊。計數的方法是只計算上邊和左邊壓線(xiàn)的細胞，而右邊和下邊壓線(xiàn)的細胞不予計算（下圖，總體原則是“計上不計下，計左不計右"，判斷標準為是否接觸三條邊線(xiàn)的中間線(xiàn)）。如果有多個(gè)細胞沒(méi)有吹散成團存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細胞。如果團塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數細胞為單個(gè)細胞